货号:02.13055-100品牌:EallBio基本售价:200.00元
过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒
货号:02.13055-100
规格:100 T
保存:4 ℃避光保存。
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致,有疑问请及时联系亿奥邦工作人员。
产品组成 |
规格 |
保存条件 |
试剂一 |
100 mL |
2-8 ℃ |
试剂二 |
10 mL |
2-8 ℃避光保存 |
试剂三 |
粉剂1支 |
2-8 ℃避光保存 |
试剂四 |
10 mL |
2-8 ℃ |
说明书 |
1份 |
产品简介:
过氧化氢酶(Catalase, CAT)又称触酶,是一类以铁卟啉为辅基的结合酶,由四个相同亚单位组成的四聚体酶,共含4分子的亚铁血红素作为辅基,分子量约为24 KD。CAT能将细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢迅速清除,可与GSH-Px共同保护巯基酶、膜蛋白、过氧化氢解离。过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(钼酸铵法)其检测原理是血清或血浆等样本中在最佳酶反应条件下,反应后剩余的H2O2与钼酸铵形成稳定的黄色复合物,其黄色深浅与酶活性成反比,通过分光光度计或酶标仪检测405 nm处吸光度。该酶的检测对于研究自由基代谢平衡,抗衰老和肿瘤发病机制具有一定的价值。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。
操作说明(仅供参考):
一、准备样品:
1. 细胞或组织样品:取恰当细胞或组织进行裂解,可以采用RIPA裂解液,如有必要可进行适当匀浆,低速离心取上清,-20 ℃冻存,用于CAT的检测。
2. 血浆、血清和尿液样品:血浆、血清按照常规方法制备,用生理盐水10倍稀释后,可以直接用于本试剂盒的测定,尿液通常也可以直接测定,不能及时检测可-20 ℃冻存。
3. 全血样品:收集适量的全血至一抗凝管内,颠倒混匀,取全血冻融一次,用试剂一稀释合适倍数后进行CAT检测。
4. 血液中的红细胞裂解液:用抗凝管收集血液,颠倒混匀。取至少500 μL全血4 ℃ 3000 g离心5 min,弃上清,沉淀用预冷的生理盐水洗涤3次。用约5倍细胞体积的预冷的去离子水,例如Milli-Q纯水,重悬细胞沉淀,冰浴10 min。使用前用试剂一稀释合适倍数后进行CAT检测。
5. 植物样品:准确称取植物材料(果肉或者去叶脉的叶片)0.5 g,剪碎,置于4 ℃预冷的研钵或匀浆器中,加入预冷试剂一1 mL,低温研磨至匀浆后转移至离心管,用3 mL试剂一冲洗研钵或匀浆器并转入离心管,加试剂一至总体积为5 mL。4 ℃ 10000 r/min离心20 min,上清液为酶提取液,上清液可用于CAT的检测。注意:如果CAT酶活性较低,应相应减少提取液的总体积,以便提高CAT酶的浓度。
6. 高活性样品:如果样品中含有较高活性的CAT,可以使用试剂一稀释。
7. (选做)样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的CAT含量。
二、配置显色液:称取0.4 g试剂三加入到10 mL蒸馏水中,充分溶解即成。现用现配。
三、CAT测定:
|
空白管 |
测定管 |
样品 |
- |
100 μL |
试剂一 |
1 mL |
1 mL |
试剂二 |
100 μL |
100 μL |
混匀37准确反应1分钟 |
||
试剂三 |
1 mL |
1 mL |
试剂四 |
100 μL |
100 μL |
试剂一 |
100 μL |
- |
测定405 nm处吸光度(分别记为A空白、A测定)。ΔA=A空白-A测定。空白管不必都做。
四、CAT活性计算:
1. 过氧化氢酶标准曲线:
过氧化氢浓度 |
4 |
8 |
12 |
16 |
20 |
25 |
50 |
100 |
吸光度 |
0.107 |
0.134 |
0.162 |
0.184 |
0.219 |
0.259 |
0.427 |
0.671 |
y = 0.007x + 0.579;x:体系中过氧化氢浓度变化值(μmol/mL),y:吸光值差值ΔA。
2. 血清(浆)CAT活力的计算:
单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化1 μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(μmol /min/mL)=(ΔA-0.579)÷0.007×V反总÷V样÷T
3. 组织、细菌或细胞中CAT活力计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化1 μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.579)÷0.007×V反总÷(V样×Cpr) ÷T
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟催化1 μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。CAT(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.579)÷0.007×V÷(W× V样÷V样总)÷T
V反总:反应体系总体积,2.3 mL;V样:加入样本体积,0.1 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
注意事项:
1. 待测样品中不应含有CAT抑制剂,同时需避免反复冻融。
2. 预实验若发现酶活性过高(A测定<0.1),可用提取液适当稀释样品后测定,并在计算公式中乘以相应稀释倍数。
3. 若A空白<A测定,一方面可能是酶活性过低,可将反应时间延长,另一方面可能样本中杂质干扰严重,可将样本稀释5倍左右后测定,并在计算公式中代入实际反应时间和乘以相应稀释倍数。
4. 试剂如果出现浑浊或絮状物,应弃用。
5. 显色液配置后可4 ℃稳定两周,如果出现乳白色物质应弃用,最好现用现配。
6. 完整的红细胞以及未稀释的溶血液中的过氧化氢酶置于4 ℃一周仍然较稳定,稀释后的溶血液中CAT容易失活。
7. 尽量避免冰冻样品造成溶血,否则过氧化氢酶活性会下降10~15%。
8. 血清样品室温下3天内活性下降64.7%,4 ℃条件下下降10.5%,-20 ℃保存30天活性仅下降3.5%。因此,待测样品均应-20 ℃或-70 ℃保存。
9. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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