保存条件：-20℃，避光，1年

产品简介：
细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒(Calcein AM, PI法，适用于FACS、FM) 通过同时检测细胞内酯酶活性和质膜完整性，提供一种判断细胞活力的荧光染色方法。本试剂盒内含有两种染料：钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)，Calcein-AM可透过活细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用由几乎无荧光的Calcein-AM脱去AM基团生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质Calcein（Ex/Em：495nm/515nm），因此活细胞可被检测到绿色荧光。另一方面PI不能透过活细胞的细胞膜，但当细胞膜受损时PI可进入到细胞内并与核酸结合，产生明亮的红色荧光（Ex/Em：535nm/617nm），因此死细胞会被检测到红色荧光。用490nm激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而用545nm激发时仅可观察到死细胞。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，但不适用于细菌和真菌。
产品规格：1000T


保存条件：
-20oC避光保存，一年有效。
操作步骤：
一、（可选）确定染色试剂的最佳浓度：
由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，建议通过以下的操作自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度：
1. 制备死细胞：细胞在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中培养10min或在70%乙醇中培养 30 min。
2. 用0.1-10μM PI工作液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3. 用0.1-10μM Calcein-AM工作液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否能被染色。
二、染色工作液的配制（以 2μM calcein AM, 8μM PI为例）：
Calcein-AM和PI推荐浓度范围为0.1~10μM，可以根据步骤一确定的最佳浓度来配制工作液。一般来说，满足信号足够的前提下，尽可能选择最低浓度的染料剂量。
1. 取出 Calcein AM Solution和PI Solution，室温平衡30分钟。
2. 在 10ml的 PBS 中加入5μl的 PI Solution和5μl的 Calcein AM Solution，涡旋震荡混匀制成工作液，此时Calcein AM的浓度为2 μM，PI的浓度为8 μM 。
3. 所得到的的工作液（2μM钙黄素AM和8μM PI）可直接用于染色细胞。
三、染色步骤： 
对于贴壁细胞：
1. 可以将细胞接种至细胞培养板、微孔板或者制作成细胞爬片。悬浮细胞也可制作成细胞 爬片。
2. 按照实验要求处理细胞后，用PBS温和洗涤细胞2-3次，确保除去培养基中含有的活性酯酶。
3. 加入足量的染色工作液，保证没过单层细胞。
4. 在 37℃孵育15~30分钟。
对于悬浮细胞：
1. 按照实验要求处理细胞后，1000 rpm离心3 min，离心后收集细胞 (1×104-5cells)。
2. 去除上清，PBS重悬洗涤2-3次，确保除去培养基中含有的活性酯酶。
3. 用 100μl染色工作液重悬细胞，使细胞密度大约为1×105-6cells/ml。
4. 在 37℃孵育15~30分钟。
四、荧光检测和分析：
 荧光显微镜检测：
1. 对于贴壁细胞：对于培养板孔中的细胞：吸出染色工作液终止孵育，加入10μl PBS，覆以干净的盖玻片。对于细胞爬片：在干净的载玻片上滴加10μl的PBS，覆以细胞爬片。可以以指甲油密封，防止水份蒸发。对于悬浮细胞：在干净的载玻片上滴加适量的染色的细胞溶液，覆以盖玻片。可以以指甲油密封，防止水份蒸发。
2. 在荧光显微镜下使用490±10nm激发波长下同时观察活细胞（黄绿色荧光）和死细胞（红色荧光）。另外使用545nm激发波长单独观察死细胞。
 流式细胞仪分析：
悬浮细胞或经胰酶消化的贴壁细胞，可以类同步骤二、三的悬浮细胞染色操作。染色后的细胞悬液可直接上机检测。
注意事项：
1. 本试剂盒中的 Calcein-AM Solution和 PI Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先适当离心至管底。
2. 由于 Calcein-AM 储存液对湿度非常敏感，请在每次使用后紧紧密封Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议根据单次用量分装密封保存。例如分装成10μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在-20℃密封避光保存。
3. 染色工作液必须现配现用，配制好的工作液请在当天使用。
4. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用本试剂盒的过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。建议染色后尽量当天完成检测。
5. 碘化丙啶对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
6. 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
 
图1 C6细胞给予紫杉醇脂质体24小时后采用本试剂盒的染色效果，Calcein AM染色浓度为0.2μM，PI染色浓度为2.5μM（A. 空白对照细胞；B. 紫杉醇脂质体1μM；C. 紫杉醇脂质体5μM；D. 紫杉醇脂质体10μM；E. 紫杉醇脂质体20μM）