Lipofect脂质体转染试剂
货号: 03.17001DA/03.17001DB
一、产品描述
外源基因导入真核细胞的方法有很多种,如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。YuanyeLipofect脂质体转染试剂(Lipofect TransfectionReagent)是一种新型的阳离子脂质体转染试剂,适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中。
YuanyeLipofect脂质体转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有较高的转染效率,较好的重复性,且操作简单以及单细胞毒性较小,可用于贴壁细胞和悬浮细胞。Lipofect脂质体转染试剂使用方法与Lipofectamine®2000Reagent极为相似。该转染试剂转染细胞时,基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响,即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。但为了取得最佳的转染效果,推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。
二、产品规格及保存条件
产品名称
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货号
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规格
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描述
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Lipofect脂质体转染试剂
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03.17001DA
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0.75ml
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适合于将核酸(DNA和RNA)转染入真核细胞,具有低细胞毒性;对多种类型的细胞和培养板都具有高转染效率;转染时血清的存在不影响转染效率的优点。
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03.17001DB
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1.5ml
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2-8℃避光保存,有效期一年。冰袋运输。
三、自备材料
1、胰蛋白酶消化液
2、完全培养液和不完全培养液
3、PBS
四、注意事项
1、注意无菌操作,尽量避免污染,
2、使用高纯度DNA或RNA有助于获得较高的转染效率,同时DNA不应含有蛋白和酚。
3、影响转染效率的因素有很多,如细胞类型、细胞状态及密度、DNA/siRNA转染量、转染试剂与DNA/siRNA比例等,应该在具体实践中优化来确定最佳转染条件。
4、为了取得较高的转染效率,推荐使用在50代以内的细胞进行转染,转染前细胞必须处于良好的生长状态。
5、为了取得较高的转染效率,推荐使用高纯度的质粒,OD260/OD280≥1.8。
6、Lipofect脂质体转染试剂不应Vortex或离心,宜缓慢晃动混匀。
7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
Lipofect脂质体转染试剂
货号: 03.17001DA/03.17001DB
操作步骤(仅供参考):
(一)DNA 转染:
1、(以12孔板为例)在转染前18~24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至12孔板中,并将细胞培养板置于37°C ,5%CO2培养箱培养,待细胞密度达到70~90%即可进行转染。后续操作步骤均按12孔板计算,如果转染器皿不同,请按比例自行调节用量。
2、在加入待转染的DNA之前2~4h,加入1ml不含抗生素的完全培养液,置于37℃,5%CO2培养箱培养。也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液,但抗生素使某些细胞转染后出现一定的细胞毒性。
3、配制转染工作液:取两个无菌离心管,分别加入50µl不含抗生素和血清的培养液,取其中一离心管加入1.6~3μgDNA,轻轻混匀;取另一离心管加入4μl Lipofect 脂质体 转染试剂,轻轻混匀。室温静置5min,将含有DNA的培养液用微量移液器轻轻加入含 Lipofect 脂质体转染试剂的培养液中,轻轻吹打混匀,室温静置20min。
4、将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中,轻轻混匀后置于37°C,5%CO2培养箱中进行培养。
5、培养4~6h后,更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞,推荐在转染4h更换培养液;对于 NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞,推荐在转染6h更换培养液。
6、继续培养24~48h后,观察或收集细胞或加入适当的筛选药物如G418进行稳定细胞株的筛选。
不同细胞器皿转染时培养液、DNA、Lipofect 脂质体转染试剂用量表
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96-well
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24-well
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12-well
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6-well
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6cm dish
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10cm dish
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铺板培养液
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0.15ml
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0.5ml
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1ml
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2ml
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5ml
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10ml
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无血清培养液
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15μl
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25μl
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50μl
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100μl
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200μl
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500μl
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DNA
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0.2μg
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0.8μg
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1.6μg
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4μg
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8μg
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24μg
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无血清培养液
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15μl
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25μl
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50μl
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100μl
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200μl
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500μl
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Lipofect 脂质体转染试剂
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0.5μl
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2μl
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4μl
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10μl
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20μl
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60μl
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注意:对于12孔板中一个孔的细胞,Lipofect 脂质体转染试剂的用量可以在3~10μl 范围内进行适当调节,DNA用量建议在1.6μg,但也可在1~4μg范围内进行适当调节。通常DNA 用量(μg)和 Lipofect 脂质体转染试剂(μl)用量比例为 1:2~3,如有必要可在1:0.5~5的范围内优化转染效果。为了获得最佳的转染效果,不同的细胞类型和培养条件有所不同,可在上述推荐范围内自行优化转染条件。
(二) siRNA 转染:
1、(以12孔板为例)在转染前18~24h用胰蛋白酶消化培养细胞,取适量对数期细胞转移至12孔板中,并将细胞培养板置于 37°C ,5% CO2 培养箱培养,待细胞密度达到 50~80%即可进行转染。后续操作步骤均按12 孔板计算 ,如果转染器皿不同 ,请按比例自 行调节用量。
2、在加入待转染的 siRNA 之前2~ 4h,加入1ml 不含抗生素的完全培养液 ,置于 37℃,5% CO2 培养箱培养。也可使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液 ,但抗生素使某些胞转染后出现一定的细胞毒性。
3、配制转染工作液:取两个无菌离心管,分别加入50µl不含抗生素和血清的培养液,取 其中一离心管加入40pmolsiRNA,轻轻混匀;取另一离心管加入2μlLipofect脂质体转染试剂,轻轻混匀。室温静置5min,将含有 siRNA的培养液用微量移液器轻轻加入含Lipofect脂质体转染试剂的培养液中,轻轻吹打混匀,室温静20min
4、将上述转染工作液逐滴滴入对应细胞培养液中,轻轻混匀后置于 37°C,5% CO2 培养箱 中进行培养。
5、培养4~6h后,更换为含有血清的完全培养液。对于Hela细胞,推荐在转染4h更换培养液;对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞,推荐在转染,6h更换培养液。
6、继续培养24~48h后,观察或收集细胞。
不同细胞器皿转染时培养液、siRNA、Lipofect 脂质体转染试剂用量表
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96-well
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24-well
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12-well
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6-well
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6cm dish
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10cm dish
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铺板培养液
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0.15ml
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0.5ml
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1ml
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2ml
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5ml
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10ml
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无血清培养液
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15μl
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25μl
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50μl
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100μl
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200μl
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500μl
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siRNA
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5pmol
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20pmol
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40pmol
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100pmol
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200pmol
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600pmol
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无血清培养液
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15μl
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25μl
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50μl
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100μl
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200μl
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500μl
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Lipofect 脂质体转染试剂
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0.25μl
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1 μl
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2 μl
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5 μl
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10μl
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30μl
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注意:对于12孔板中一个孔的细胞,Lipofect脂质体转染试剂的用量可以在1~4μl范围内进行适当调节,siRNA用量建议在20~80pmol范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和Lipofect脂质体转染试剂(μl)的用量比例20:1,如有必要可在 10~40:1范围内优化转染效果.为了获得最佳的转染效果,不同的细胞类型和培养条件有所不同,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件.siRNA 的推荐浓度为 20µ M,常用的浓度范围为10~50µM。对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的 Lipofect 脂质体转染试剂和siRNA 混合物分别配制,然后一起混合在同一个离心管内 ,后续混匀并孵育 20min后,按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内.对于其它培养板或培养器皿,各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或 RNA等可以参考转染DNA的条件进行。